En construcción como
la vida misma
Identificación de los productos quÃmicos que imitan transcripcional cambios asociados
con el autismo , el envejecimiento
cerebral y la neurodegeneración
Los factores ambientales, tales como plaguicidas, se han relacionado
con el autismo y neurodegeneración riesgo mediante estudios
epidemiológicos retrospectivos. Aquà hemos tratado de identificar
prospectivamente los productos quÃmicos que comparten las firmas de transcriptómica con trastornos neurológicos, mediante la exposición de cultivos de neuronas corticales enriquecida ratón para cientos de sustancias quÃmicas que se encuentran comúnmente en el ambiente y en los alimentos. Encontramos que la rotenona, un pesticida relacionado con el riesgo de la enfermedad de Parkinson, y ciertos fungicidas, incluyendo piraclostrobina, trifloxistrobina, famoxadona y fenamidona, producir cambios transcripcionales en vitro que son similares a los observados en muestras de cerebro de los seres humanos con autismo, la edad avanzada y la neurodegeneración ( la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Huntington). Estos productos quÃmicos estimulan la producción de radicales libres y alteran los microtúbulos en las neuronas, los efectos que se pueden reducir mediante el pretratamiento con un estabilizador de microtúbulos, un antioxidante, o con sulforafano. Nuestro estudio proporciona un enfoque para identificar prospectivamente los productos quÃmicos ambientales que los trastornos de autismo y otros cerebrales imitan transcripcionalmente.
IÃndice de figuras de Identificación de los productos quÃmicos que imitan transcripcional cambios asociados con el autismo , el envejecimiento cerebral y la neurodegeneración
Introducción
Las nuevas y poderosas tecnologÃas de secuenciación se han utilizado para identificar sistemáticamente cientos de mutaciones de genes candidatos asociados con el trastorno del espectro autista riesgo (TEA).
Los estudios de heredabilidad sugieren que los factores ambientales también contribuyen al riesgo de autismo.
De hecho, la exposición a los pesticidas gestacional, incluyendo materna proximidad a la aplicación de pesticidas y la escorrentÃa, se asocia de forma reproducible con un mayor riesgo de ASD en estudios epidemiológicos.
Sin embargo, los estudios epidemiológicos son retrospectivos y no se puede determinar de manera prospectiva, precisamente, o de manera sistemática que los productos quÃmicos, de los> 80.000 productos quÃmicos registrados para su uso en el medio ambiente, tienen el mayor potencial para dañar el cerebro en desarrollo o adulto.
existentes in vivo del desarrollo neurológico y neurotoxicológicos ensayos en modelos animales con mucha mano de obra y costoso, lo que dificulta el rendimiento, mientras que los ensayos toxicológicos de mayor rendimiento con frecuencia utilizan las células no neuronales o se centran en la muerte de neuronas como un punto final.
Como resultado, estas pruebas fallan para interrogar a los procesos moleculares y fisiológicas que son únicos para las neuronas o que diferencian normal a partir de los cerebros humanos enfermos.Existe un reconocimiento creciente de que los cambios de la transcripción del cerebro están asociados con TEA 10, 11. Esta transcripcional firma ASD se define por la reducción de expresión de genes implicados en la transmisión sináptica y la elevada expresión de genes implicados en la función inmune y la microglia.
En este caso la hipótesis de que esta firma transcripcional podrÃa orientar la identificación prospectiva de los riesgos quÃmicos que podrÃan utilizarse para ASD. Para probar esta hipótesis, se exponen cultivos de neuronas corticales de ratones enriquecida con cientos de productos quÃmicos de uso ambiental y se controlará los cambios globales de la transcripción. Identificamos seis grupos quÃmicos, uno de los cuales imita la transcripción cambios observados en los TEA, pero sorprendentemente también comparte similitud de la transcripción en el cerebro envejecido y ciertas enfermedades neurodegenerativas. Nuestros hallazgos sugieren que estas condiciones neurológicas comparten una patologÃa molecular, como hipótesis por otros, a pesar de las diferentes edades de inicio y sÃntomas de comportamiento distintos. Por otra parte, nuestro estudio demuestra que un enfoque de la transcripción se puede utilizar para escanear de forma sistemática un espacio quÃmica diversa e identificar potenciales amenazas ambientales para el cerebro humano. resultados
Introducción
Las nuevas y poderosas tecnologÃas de secuenciación se han utilizado para identificar sistemáticamente cientos de mutaciones de genes candidatos asociados con el trastorno del espectro autista riesgo (TEA).
Los estudios de heredabilidad sugieren que los factores ambientales también contribuyen al riesgo de autismo.
De hecho, la exposición a los pesticidas gestacional, incluyendo materna proximidad a la aplicación de pesticidas y la escorrentÃa, se asocia de forma reproducible con un mayor riesgo de ASD en estudios epidemiológicos.
Sin embargo, los estudios epidemiológicos son retrospectivos y no se puede determinar de manera prospectiva, precisamente, o de manera sistemática que los productos quÃmicos, de los> 80.000 productos quÃmicos registrados para su uso en el medio ambiente, tienen el mayor potencial para dañar el cerebro en desarrollo o adulto.
existentes in vivo del desarrollo neurológico y neurotoxicológicos ensayos en modelos animales con mucha mano de obra y costoso, lo que dificulta el rendimiento, mientras que los ensayos toxicológicos de mayor rendimiento con frecuencia utilizan las células no neuronales o se centran en la muerte de neuronas como un punto final.
Como resultado, estas pruebas fallan para interrogar a los procesos moleculares y fisiológicas que son únicos para las neuronas o que diferencian normal a partir de los cerebros humanos enfermos.Existe un reconocimiento creciente de que los cambios de la transcripción del cerebro están asociados con TEA 10, 11. Esta transcripcional firma ASD se define por la reducción de expresión de genes implicados en la transmisión sináptica y la elevada expresión de genes implicados en la función inmune y la microglia.
En este caso la hipótesis de que esta firma transcripcional podrÃa orientar la identificación prospectiva de los riesgos quÃmicos que podrÃan utilizarse para ASD. Para probar esta hipótesis, se exponen cultivos de neuronas corticales de ratones enriquecida con cientos de productos quÃmicos de uso ambiental y se controlará los cambios globales de la transcripción. Identificamos seis grupos quÃmicos, uno de los cuales imita la transcripción cambios observados en los TEA, pero sorprendentemente también comparte similitud de la transcripción en el cerebro envejecido y ciertas enfermedades neurodegenerativas. Nuestros hallazgos sugieren que estas condiciones neurológicas comparten una patologÃa molecular, como hipótesis por otros, a pesar de las diferentes edades de inicio y sÃntomas de comportamiento distintos. Por otra parte, nuestro estudio demuestra que un enfoque de la transcripción se puede utilizar para escanear de forma sistemática un espacio quÃmica diversa e identificar potenciales amenazas ambientales para el cerebro humano.
Resultados:
Ratón cultivos corticales transcripcionalmente modelo de cerebro humano Para determinar si el ratón cultivos corticales modelo aspectos celulares y moleculares del cerebro humano, se realizó inmunohistoquÃmica con marcadores celulares y compararon el perfil de expresión génica de nuestras culturas con conjuntos de datos de expresión cerebral de tipo de células especÃficas y conjuntos de datos de expresión de genes del cerebro humano, incluidos los atlas Allen BrainSpan (www.brainspan.org) y GTEx.
Nuestras culturas contenÃa muchos de los tipos de células principales del cerebro basado en inmunocitoquÃmica con marcadores para neuronas, astrocitos y microglia (~ 25% de los cultivos eran células no neuronales ; la Fig. 1a, b). Además, la expresión de marcadores para cada type13 de las células cerebrales en nuestros cultivos fue altamente correlacionada con la de todo el cerebro embrionario (E14.5) (Pearson r = 0,8), lo que sugiere, además, que nuestro sistema de cultivo representa todas las clases principales de células en biológicamente realista proporciones (Fig. 1c;. complementario figura 1a, b). A nivel mundial, la expresión génica en nuestros cultivos corticales correlaciona más fuertemente con cada región del cerebro humano (excepto la médula espinal) que a ningún otro tejido del cuerpo humano (complementario Fig. 2a). Las correlaciones más fuertes fueron a la corteza frontal y la corteza cingulada anterior, las regiones implicadas en ASD3. Por otra parte, los cultivos fueron más fuertemente correlacionadas con la corteza frontal del cerebro de gestación mediados-finales humana (Suplementario Fig. 2b), la ventana de tiempo de desarrollo implicados en TEA patogenesia.
En contraste, las neuronas terminalmente diferenciadas derivadas de cells16 madre de embriones humanos no se correlacionan fuertemente con cualquier región del cerebro, y en su lugar fueron más similares a los tejidos asociados con el sistema reproductor femenino (complementario Fig. 2c).
Tomados en conjunto, nuestros cultivos corticales muestran fuertes similitudes de la transcripción en el cerebro humano.
Transcripcional pantalla con productos quÃmicos ambientales
A continuación mide la citotoxicidad de las 294 sustancias quÃmicas en la biblioteca ToxCast Fase I (EPA) Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos, que incluye los pesticidas comunes de uso de los alimentos y otros productos quÃmicos ambientales, tales como plastificantes, para identificar a una concentración no tóxica para la secuenciación de ARN (ARN -seq).
Se han tratado los cultivos por cuadruplicado durante 24 horas a 10 M, ya que esto es una concentración común usado en la detección estudios17, entonces se utiliza marcadores fluorescentes para cuantificar la proporción de células vivas y muertas (Fig complementario. 3). La mayorÃa (87%) de los productos quÃmicos no se citotóxico a 10 micras, mientras que las concentraciones de los productos quÃmicos restantes tuvieron que ser reducido a entre 10 y 100 nM (de datos 1). cultivos frescos se trataron luego (24 h) con cada producto quÃmico a la concentración no tóxica o con vehÃculo (dimetilsulfóxido equivalente (DMSO) concentración ≤0.5%), como el control negativo.
También hemos probado tres inhibidores de la topoisomerasa 1 (TOP1), ya que regulan negativamente de forma reproducible (> 100 kb) genes18 larga. Para identificar los productos quÃmicos que causaron genes concordantes cambios de expresión, se realizó la agrupación jerárquica de 5.121 genes expresados ​​de diversas formas a través de todos los productos quÃmicos, y resurgido seis grupos quÃmicos (en lo sucesivo, las agrupaciones 1-6; Fig. 2; ver Métodos y complementario Figura 4 para. detalles de corrección de lote).
Productos quÃmicos individuales fueron asignados a un clúster utilizando un umbral de correlación por pares y se validaron estadÃsticamente y biológicamente significativas (figura 5 suplementario;. ver Métodos para más detalles sobre los criterios de inclusión / exclusión). Para evaluar si existe in vitro ToxCast datos del ensayo podrÃan identificar las relaciones quÃmicas similares, se realizó el análisis de agrupación a través de 199 ensayos y celular libres de células (no neuronales). Las agrupaciones quÃmicas resultantes no se parecen a las que detectamos perfiles de expresión génica (Fig. 6 suplementario).
Por lo tanto, el perfil transcripcional con células neuronales identifica las relaciones entre los productos quÃmicos que los análisis toxicológicos existentes no pudo detectar. Figura 2: La expresión de genes define seis grupos quÃmicos en cultivos de neuronas corticales.
Para determinar cuáles eran estas relaciones funcionales, se examinaron los genes especÃficos con expresión alterada en cada grupo (Fig. 2). Grupo 1 productos quÃmicos regulados por incremento genes tempranos (IEGs), mientras que la reducción de la expresión de varios genes de canales de potasio.
Estos cambios de expresión eran sugerentes de la hiperexcitabilidad neuronal. En apoyo de esta posibilidad, el grupo 1 incluyó dos piretroides (ciflutrina y FenpropatrÃn) que estimulan el flujo de calcio sostenida en neurons19 cortical. Cluster 2 productos quÃmicos regulados por incremento numerosas transcripciones inmunes y del citoesqueleto, pero reducen la expresión del canal iónico y los genes sinápticos. Grupo 3 productos quÃmicos regulados por incremento IEGs pero redujeron la expresión de los genes inmunes y del citoesqueleto.
El grupo 4 se parecÃan a los productos quÃmicos grupo 3, pero sin inducir IEGs. Cluster 5 contenÃa los tres inhibidores de TOP1, que marcadamente downregulated genes largos y downregulated IEGs, de conformidad con uno de estos inhibidores (topotecan) la reducción de la actividad sináptica espontánea en cultures20 neurona cortical. Supresión de una topoisomerasa relacionado (TOP2B) redujo IEG expression21. Grupo 6 quÃmicos expresión reducida de varias subunidades de receptores de neurotransmisor, incluyendo subunidades N-metil-D-aspartato (GRIN2A y Grin2b), receptores colinérgicos (CHRM2 y Chrna7) y canales iónicos. Grupo 2 transcripcionalmente imita trastornos cerebrales especÃficas
A continuación identificamos las vÃas moleculares que se asocian diferencialmente con los seis grupos quÃmicos utilizando el análisis conjunto de genes (GSA).
Se incluyen en este análisis fueron 64 conjuntos de genes para los trastornos del cerebro humano y las vÃas del sistema nervioso que generamos a partir de publicaciones (de datos 2) junto a 4.722 vÃas curada. Más de 600 conjuntos de genes distinguen los seis grupos (Fig complementaria 7;. Complementario de datos 3), incluyendo muchos de los conjuntos humanos trastorno cerebral de genes (Fig. 3).
Sin embargo, sólo el grupo de 2 productos quÃmicos imitaban los cambios transcripcionales de dos conjuntos de datos de expresión TEA cerebrales post-mortem de manera bidireccional. Esto incluyó regulación a la baja de M12 y Mod1 (compuesto en gran parte de los genes sinápticas que están regulados a la baja en los cerebros de ASD), y la regulación positiva de M16 y MOD5 (compuesto en gran parte de microgliales genes / inmunes que están regulados al alza en los cerebros TEA) 10, 11.
Además, racimo 2 mostraron concordancia con el envejecimiento del cerebro humano y dos trastornos neurodegenerativos (enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Huntington), lo que sugiere aspectos comunes de la patologÃa molecular a pesar de diferentes sÃntomas (véase la discusión). Figura 3: 2 Cluster quÃmicos muestran significativa de enriquecimiento conjunto de genes con autismo y otras enfermedades del cerebro.
Fenamidona, piraclostrobina y otras dos sustancias quÃmicas en el grupo 2 (famoxadona y trifloxistrobina) son miembros de una clase reciente desarrollo de fungicidas que inhiben el complejo mitocondrial III apuntando a la quinona fuera de sitio (Qo) del citocromo BC1 (Ref. 22). Desde fenamidona y piraclostrobina son estructuralmente distintos (Fig. 4a, b), se realizó RNA-seq con múltiples repeticiones de tanto los productos quÃmicos para validar aún más que la expresión de un conjunto común de genes fue alterado.
Cada expresión alterada fungicida de un conjunto superponen en gran medida de los genes (Figura 4c, d;. Complementario de datos 4). transcripciones upregulated incluyen objetivo Nrf2 respuesta de los genes antioxidantes y descanso, que validaron utilizando cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) (Fig. 4e, f). elevación resto se asocia con el envejecimiento del cerebro humano y la neurodegeneración. Otros compuestos en el grupo 2 incluyen fenpiroximato, piridaben y rotenona, los productos quÃmicos que se dirigen complejo I mitocondrial (Ref. 24). La exposición a la rotenona se sabe que aumenta el riesgo para la enfermedad de Parkinson. Todo racimo 2 quÃmicos reducida RNA-seq lee derivada del genoma mitocondrial (Fig. 2), lo que sugiere la función mitocondrial comprometida como mechanism26 común.
Tenga en cuenta que ninguna de las transcripciones mitocondrial codificados estaban entre los 5.121 genes expresados ​​de diversas formas ensayadas por la agrupación jerárquica, por lo que estas transcripciones no influyó en la asignación de clúster. Sin embargo, la influencia del tratamiento quÃmico sobre la densidad mitocondrial o viabilidad no fue evaluado y podrÃa haber modulada indirectamente perfiles de transcripción.
Figura 4: 2 Cluster quÃmicos alteran la expresión de un conjunto común de genes.
Grupo 2 induce dismutasa y la inestabilidad de los microtúbulos complejos mitocondriales I y III son los principales sitios de superóxido (O2-) la producción dentro de la cadena de transporte de electrones, por lo que luego probaron si racimo 2 sustancias quÃmicas inducidas O2. Fenamidona produjo un aumento dependiente de la concentración de O2, tal como se mide con un colorante indicador dismutasa mitocondrial fluorescente, y la hinchazón de soma neuronal (Fig. 5a-d). El pretratamiento con el eliminador de vitamina E por radicales libres (α-tocoferol) bloqueado producción fenamidona inducida de O2- (Fig 5e;. Usando la concentración de fenamidona que se utilizó para la secuenciación) y bloqueó soma hinchazón (Fig 5f.). El sulforafano es un potente inductor de Nrf2 expresión del gen diana antioxidante, reduce la inflamación y reduce sustancialmente los sÃntomas de autismo en los seres humanos. El pretratamiento con sulforafano atenúa los cambios transcripcionales, O2- producción y soma hinchazón causada por la fenamidona (Fig. 6). Se controlaron la producción de O2 para cada producto quÃmico en el grupo 2 y para varios productos quÃmicos fuera del grupo 2 en un rango de concentración-respuesta de siete puntos (Fig. 8 Complementario). Todos los productos quÃmicos que indujeron O2- a la concentración de secuenciación fueron asignados al grupo 2 sobre la base de la expresión génica. Fluoxastrobina y azoxistrobina son fungicidas Qo que no fueron asignados al grupo 2, probablemente porque no generan O2 en la concentración de la secuencia (Fig. 8 Complementario). Dos inhibidores mitocondriales adicionales que inducen la producción de O2 en las células (myxothiazol, complejo inhibidor III; cresoxim-metilo, complejo inhibidor III y fungicida) transcripción modificado de una manera compatible con los productos quÃmicos en el grupo 2 (Fig complementario 9.). En conjunto, nuestros datos apoyan una relación entre la producción de O2 y la firma transcripcional grupo 2.